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歷史概述和定義

液相色譜的定義是二十世紀(jì)早期由俄羅斯植物學(xué)家 MikhailS. 茨維特提出的。他更先嘗試在裝滿顆粒的柱子上使用溶劑來(lái)分離從植物中提取的化合物(樹(shù)葉色素)。茨維特用顆粒填滿開(kāi)口的玻璃柱。他發(fā)現(xiàn)兩種特殊的材料，粉筆末(碳酸鈣)和氧化鋁很有用。他將樣品(混勻植物葉的溶劑提取物)倒入柱中，并讓樣品流過(guò)顆、粒床。隨后加入純?nèi)軇?。隨著樣品由于重力自上而下流過(guò)柱子，可看到不同顏色的譜帶被分開(kāi)，因?yàn)橛行┙M分比另外一些移動(dòng)得快。他將這些分開(kāi)的不同顏色的譜帶與樣品中原有的不同化合物相關(guān)聯(lián)。他還根據(jù)每一種化合物對(duì)填料的化學(xué)親和性強(qiáng)弱，提出了分析這些化合物的分離規(guī)律。與顆粒填料有較強(qiáng)親和性的化合物移動(dòng)慢，與溶劑有較強(qiáng)親和性的化合物移動(dòng)快。這個(gè)過(guò)程可這樣描述:樣品中的化合物在流動(dòng)的溶劑(流動(dòng)相)與固體顆粒(固定相)間的分布不一樣。這樣使每一種化合物以不同的速度移動(dòng)，從而產(chǎn)生了化合物之間的分離。

茨維特使用色譜法 chromatography (來(lái)自希臘字，chroma 意思是顏色，graphy 意思是記錄，直譯為顏色記錄)來(lái)描述他的彩色試驗(yàn)。(令人好奇的是,俄羅斯名字茨維特意思是顏色。)今天，液相色譜法，以各種形式，已成為分析化學(xué)中有力的工具之一。

圖A

技術(shù)1. 樣品被點(diǎn)在固定在玻璃板上的薄層色譜顆粒(固定相)上，并流過(guò)薄層(圖 B)。玻璃板的底端放置在溶劑中。由毛細(xì)作用產(chǎn)生的流動(dòng)使溶劑[流動(dòng)相]擴(kuò)散到干燥的顆粒層并沿玻璃板向上移動(dòng)。這種技術(shù)被稱(chēng)為薄層色譜法或TLC。

圖B

技術(shù) 2. 在圖 C 中,樣品被點(diǎn)在紙上(固定相)。溶劑(流動(dòng)相)加在樣品點(diǎn)的中心以產(chǎn)生向周?chē)妮椛淞鲃?dòng)。這是紙層析的一種方式。(傳統(tǒng)的紙層析色譜和直線流動(dòng)的薄層色譜是類(lèi)似的操作方式。)上圖中，相同的黑色 FD 和 C 染料被點(diǎn)在紙上。

圖C：紙層析法

當(dāng)和薄層色譜板比較的時(shí)候，請(qǐng)注意這種特殊紙張分離能力的區(qū)別。綠色圓環(huán)表示這張紙無(wú)法分離黃色和藍(lán)色染料，但它可以將紅色染料分離開(kāi)來(lái)。下圖中，由同樣的黃色和藍(lán)色染料組成的一個(gè)綠色樣品點(diǎn)在紙上。如你能預(yù)料的，這張紙無(wú)法分離這兩個(gè)染料。在圖中，由紅色和藍(lán)色組成的紫色樣品被點(diǎn)在紙上，它們被分離得很好。

技術(shù)3.在這個(gè)有效的方法中，樣品流進(jìn)一個(gè)柱子或填有適當(dāng)顆粒(固定相)的柱管裝置。這些顆粒稱(chēng)為色譜填料。溶劑(流動(dòng)相)流過(guò)這個(gè)裝置。在固相萃取中(SPE)，樣品被裝入柱管里，溶劑攜帶樣品流出這個(gè)裝置。正如在茨維特的試驗(yàn)中，樣品中化合物由于在管路中的流動(dòng)速度不同而得以分開(kāi)。黑色樣品被放入柱管里。每一步使用不同溶劑得到分離。

圖D-1：柱色譜法-固相萃取(SPE)

當(dāng)使用管路的形式時(shí)，有幾種方法可以產(chǎn)生流動(dòng)。重力或真空可用在不能承受壓力的柱子上。特別是，本試驗(yàn)中使用的顆粒粒徑較大(大于五十微米)，所以產(chǎn)生的流動(dòng)阻力很小。開(kāi)口玻璃柱(茨維特的實(shí)驗(yàn))是個(gè)典型的例子。除此之外，小型塑料柱，典型的例子是針筒的形狀，可裝入填充物顆粒用于分離樣品。這種方法稱(chēng)為固相萃取(SPE)。在此，管狀的色譜裝置稱(chēng)為固相萃取小柱，通常在真空助力下流動(dòng)，被用來(lái)凈化復(fù)雜樣品以便進(jìn)一步分析。要想提高分離能力，必須使用粒徑小的填料顆粒(小于十微米)。然而，小顆粒對(duì)流動(dòng)產(chǎn)生更大的阻力，所以要獲得預(yù)期的溶劑流速，需要更高壓力。必須設(shè)計(jì)能承受更高壓力的泵和柱子。利用中高壓力使溶劑流過(guò)色譜柱的方法，就稱(chēng)為HPLC。

圖D-2：HPLC柱

什么是液相色譜法(HPLC)?

縮寫(xiě) HPLC, 引自 Csaba Horváth 教授之后在 1970 年匹茨堡大會(huì)上的文章，原指在填料柱中產(chǎn)生所需的流速需要高壓(high-pressure) 這個(gè)事實(shí)。早期的泵只能承受500 psi (35bar)。這就被稱(chēng)為高壓液相色譜法(HPLC)七十年代早期取得極大進(jìn)步。新型的高壓液相色譜儀器可以承受 6,000psi (400 bar)的壓力，還能配上改進(jìn)的進(jìn)樣器，檢測(cè)器和色譜柱。高壓液相色譜法確實(shí)開(kāi)始成為二十世紀(jì)七十年代中晚期的普遍分析方法。隨著這一期間不斷的性能改進(jìn)(更小顆粒，更高壓力), 字母縮寫(xiě)保持一樣，但全稱(chēng)變?yōu)?/span>(high-performance) 液相色譜(HPLC)。液相色譜(HPLC)是目前分析化學(xué)更強(qiáng)大的工具之一。它能夠分離、定性和定量任何可以溶解在液體中的化合物。今天，痕量化合物甚至低至千萬(wàn)分之一(ppt)也可。

一個(gè)儲(chǔ)液瓶裝有溶劑(稱(chēng)為流動(dòng)相，因?yàn)槿軇┦橇鲃?dòng)的)。一個(gè)高壓泵(溶劑傳輸系統(tǒng)或稱(chēng)溶劑管理器)用來(lái)產(chǎn)生和計(jì)量流動(dòng)相的流速，一般是毫升/分鐘。一個(gè)進(jìn)樣器(樣品管理器或自動(dòng)進(jìn)樣器)可以將樣品導(dǎo)入(注射)連續(xù)的流動(dòng)相，并由流動(dòng)相攜帶樣品進(jìn)入液相色譜柱。色譜柱裝有能獲得分離效果的填料。這種填料稱(chēng)為固定相因?yàn)樗恢布鼑?。檢測(cè)器用來(lái)查看化合物流出色譜柱時(shí)被分開(kāi)的譜帶(大多數(shù)化合物沒(méi)有顏色，所以人眼觀察不到)。流動(dòng)相流出檢測(cè)器可被送至廢液瓶，或按需被收集。當(dāng)流動(dòng)相含有一個(gè)分開(kāi)的化合物譜帶，液相色譜可以收集含有純化的化合物的該洗脫組分，用于進(jìn)一步分析。這種方法稱(chēng)為制備液相(在液相色譜量級(jí)中討論)。注意高壓管路和附件用來(lái)連接泵、進(jìn)樣器、色譜柱和檢測(cè)器單元，形成流動(dòng)相、樣品和化合物分離譜帶的通路。

圖E 描述了液相色譜系統(tǒng)的各組成部分

檢測(cè)器連接計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)站，液相色譜儀系統(tǒng)單元先記錄電信號(hào)，再將電信號(hào)轉(zhuǎn)換為色譜圖，在顯示屏上展現(xiàn)出來(lái)。定性和定量樣品內(nèi)溶物濃度(如圖F)。由于樣品中化合物性質(zhì)差異很大，幾種類(lèi)型的檢測(cè)器被開(kāi)發(fā)出來(lái)。例如，如果一個(gè)化合物能吸收紫外光，可使用紫外吸收檢測(cè)器。如果這個(gè)化合物發(fā)熒光，可使用熒光檢測(cè)器。如果該化合物沒(méi)有上述性質(zhì)之一，可使用更廣泛的檢測(cè)器，如蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)。更強(qiáng)大的方式是順序使用多個(gè)檢測(cè)器。例如，紫外和/或蒸發(fā)光檢測(cè)器可和質(zhì)譜儀(MS)聯(lián)用來(lái)分析色譜分離的組分。這樣，從一次進(jìn)樣，可得到分析物的更多綜合的信息。將質(zhì)譜與液相色譜系統(tǒng)耦合稱(chēng)之為液質(zhì)用.